納米材料對厭氧氨氧化工藝的影響研究進展
摘要：厭氧氨氧化（Anammox）作為一種新型的自養脫氮工藝，由于其不需要外加碳源、污泥產量少、運行費用低等一系列優勢，被認為是一種高效、經濟的污水生物脫氮工藝。而納米材料（nanomaterials，NMs）作為21世紀最有前途的材料，其廣泛應用不可避免地會使納米顆粒釋放到水體中，從而對厭氧氨氧化污水脫氮處理產生影響。選取了污水中含有的若干典型納米材料，結合現有文獻，從長短期影響、毒性機理、微生物的抗毒機制等角度綜述納米材料對厭氧氨氧化過程的影響，旨在全面分析不同類型的納米材料對厭氧氨氧化過程的作用機制，為提升厭氧氨氧化脫氮效率提供參考依據。
張云暮，碩士研究生，主要研究方向為污水處理與資源化。
納米材料由于其獨特的性質已被廣泛使用，其應用過程中的副產品之一就是納米顆粒，納米顆粒粒徑通常在40～100nm之間，其中40～60nm的納米顆粒占比達到了46.1%。在制造、運輸和應用的過程中，納米顆粒（Nanoparticles，NPs）不可避免地會被釋放到環境中，最終在污水中被無害化處理。
現階段，在許多污水中都能檢測到納米顆粒的存在，例如在紡織廢水中，納米氧化鋅累積濃度可達到150μg/L。而市政污水中納米銀的濃度范圍主要在 0.1～0.2μg/L之間，同時在市政污水中檢測到納米二氧化鈦的濃度為181～1233μg/L，這是由于納米二氧化鈦在醫藥、表面涂料和化妝品中被廣泛使用。盡管目前污水中部分納米顆粒的濃度還未達到較高水平，但是隨著納米科技的快速發展，含納米材料的消費品將呈顯著上升趨勢，納米顆粒在環境中的濃度將不斷增加，其對污水處理的潛在影響不能被忽視。
厭氧氨氧化（Anaerobic Ammonium Oxidation，Anammox）作為一種新型的自養脫氮工藝，被認為是最高效、最具經濟效益的污水脫氮技術之一。然而，厭氧氨氧化菌很容易受到進水水質波動的影響，污水中的納米顆粒會對其產生正面或負面的影響。
到目前為止，許多試驗研究結果表明納米材料對細菌、藻類和哺乳動物都具有一定的毒性，但是不同類型的納米材料之間的毒性效果并不一致。為此，筆者從厭氧氨氧化工藝的角度出發，結合現有研究文獻，從長期和短期影響、毒性機理、微生物的抗毒機制等角度綜述納米顆粒對厭氧氨氧化過程的影響，同時還提出今后的發展趨勢和研究方向。
01 納米材料對厭氧氨氧化菌活性的影響
根據最近的納米技術與材料消費品目錄，金屬和金屬氧化物納米材料是使用最廣泛的兩種納米材料，占全球納米產品總量的37%。不同納米材料的理化性質隨著尺寸、形狀、化學成分和表面結構而變化，因此，上述這些材料對厭氧氨氧化菌所造成的影響也不盡相同。
納米材料的一些常見特點（如表面、形態、材質、特性等）見圖1。
1.1 金屬納米材料
在厭氧氨氧化系統中，Cu、Fe和Ag是研究最廣泛的三種金屬納米材料，Gonzalez?Estrella等研究表明，0.50mmol/L的納米銅顆粒（CuNPs）使厭氧氨氧化菌的活性降低了82.9%。Zhang等的試驗得到了類似結果，CuNPs在短期試驗（4h）中顯著抑制了厭氧氨氧化活性，而長期暴露于5mg/L 的CuNPs使得反應器在30d內幾乎失去了所有的脫氮能力。零價納米鐵（nZVI）與CuNPs不同，nZVI對厭氧氨氧化菌的生長具有促進作用，在暴露于低濃度nZVI（濃度<5mg/L）條件下，厭氧氨氧化菌活性（SAA）顯著提高，因此nZVI可以加速厭氧氨氧化系統的啟動。然而短期高濃度nZVI釋放的可溶性亞鐵離子可能對厭氧氨氧化菌產生危害，但是損害是可恢復的。納米銀顆粒（AgNPs）由于其具有抗菌能力對微生物具有較大的毒性。Li等在AgNPs對厭氧氨氧化的影響研究中得出，短期低濃度（1mg/L）的AgNPs暴露對厭氧氨氧化系統沒有明顯的抑制作用，提高AgNPs濃度（10mg/L）后厭氧氨氧化菌受到抑制，并且隨著暴露時間的延長系統脫氮能力并沒有得到恢復。
1.2 金屬氧化物納米材料
金屬氧化物納米材料的毒性不同于金屬納米材料。例如，Zhang等對比了納米氧化銅（CuONPs）和CuNPs對厭氧氨氧化的短期和長期影響。結果表明，CuONPs對厭氧氨氧化菌長期和短期活性的抑制作用均大于CuNPs，長期暴露于CuONPs中總氮去除效率最低降至14%，脫氮能力顯著下降。
其他金屬氧化物納米顆粒對厭氧氨氧化系統的影響也不盡相同。研究發現，ZnONPs短期內對厭氧氨氧化過程具有抑制作用，然而ZnONPs的長期抑制作用是可逆的，并且通過增加氨氮濃度，可以緩解ZnONPs對厭氧氨氧化系統的抑制作用。Xu等在NiONPs作為抑制劑的試驗中發現，在添加的NiONPs濃度為2～10 mg/L時，總氮去除效率小幅提升。反應器性能的提升可能與NiONPs釋放Ni2+有關，因為低水平的Ni2+是厭氧氨氧化菌的一種必需的微量營養元素，而高濃度的NiONPs顯著抑制了厭氧氨氧化菌活性。此外，還有多種金屬氧化物納米顆粒會對厭氧氨氧化菌群落結構和污泥性質產生負面影響，如SiO2、CeO2、Al2O3、TiO2等，它們對厭氧氨氧化菌的抑制順序為：SiO2>CeO2>Al2O3>TiO2。這可能是由于它們獨特的物理和化學性質決定了它們釋放金屬離子的能力以及與微生物的相互作用。
02 納米材料對厭氧氨氧化菌影響的作用機理
納米材料的生物毒性一般與細胞結構和功能的破壞有關。納米材料對厭氧氨氧化系統影響的作用機理主要分為金屬離子的釋放以及納米效應兩大類，在厭氧氨氧化菌接觸到有毒納米顆粒之前，其細胞外層的胞外聚合物（EPS）會先吸附納米顆粒及其釋放出的金屬離子，在納米顆粒與細胞膜接觸后，通過細胞中的金屬蛋白酶（一種轉運酶）發生跨膜運輸，在細胞體內累積并產生毒性，其影響在厭氧氨氧化菌中則表現為細胞膜結構的破壞、毒性中間產物的積累和代謝破壞，如圖2所示。事實上，某些納米顆粒對微生物的毒性可能涉及上述一種或多種途徑。
2.1 金屬離子的釋放
許多研究表明，納米顆粒在缺氧或無氧條件下的抗菌機理歸因于有毒金屬離子的釋放。從納米顆粒中釋放出來的金屬離子比納米顆粒更容易滲透到細胞內部，從而產生毒性。溶解的金屬離子會大量附著在細胞表面，然后滲透到細胞中，導致金屬離子在細菌細胞質中的積累。影響金屬離子釋放量的因素包括納米材料類型、溶解氧、pH值等。
釋放的金屬離子對厭氧氨氧化菌的不利影響之一是導致關鍵酶失活。例如，90%以上溶解的Cu2+離子存在于污泥中，而不是液相或出水中。CuNPs釋放的可溶性Cu2+離子可破壞細胞膜，導致細胞溶解，并由于銅與其他蛋白質功能組的親和力而導致酶功能的破壞，從而擾亂厭氧氨氧化菌的代謝。類似情況如ZnONPs對厭氧氨氧化菌的抑制也是由于其在液相中的溶解釋放了有毒的Zn2+離子。據測算，1.0、5.0和10mg/L的 ZnONPs溶解所產生的Zn2+離子濃度分別為0.5、2.7和4.1mg/L。又例如，NiONPs對厭氧氨氧化系統的促進作用是由于其釋放出的Ni2+為微生物生長所必需的營養元素。有研究表明，60mg/L的 NiONPs釋放的Ni2+濃度為（13.53±4.29）mg/L。同樣對厭氧氨氧化菌具有促進作用的還有nZVI溶解反應產生的溶解態Fe2+，這主要是因為鐵是許多含血紅素酶的關鍵成分，這些酶在厭氧氨氧化菌分解代謝中有著重要的作用。
值得注意的是，厭氧氨氧化反應會導致堿度增加，以及由于配體交換或靜電吸引作用，大量的納米顆粒在細胞表面聚集或沉淀，然后與EPS、SMP甚至細胞膜功能基團相互作用，這些過程均可以加速納米顆粒中金屬離子的釋放。
2.2 活性氧簇及乳酸脫氫酶的抑制作用
活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）又稱活性氧自由基。在關于納米顆粒毒性的研究中，ROS被認為是產生微生物毒性和細胞損傷的主要原因之一。由于光照是ROS產生的前提條件，因此在厭氧氨氧化的避光環境中，即使水體中存在納米顆粒，也不會產生光催化活性氧。然而微生物的生命活動會產生胞內活性氧，同時有研究證實納米顆粒的存在會誘導胞內活性氧的產生和累積，高水平的ROS含量會對脂質和細胞膜造成氧化損傷，誘導一系列細胞內反應，進而影響微生物的正常代謝。Hou等在CuONPs對厭氧氨氧化的影響研究中發現，納米顆粒會導致活性氧自由基的生成和乳酸脫氫酶（LDH）的釋放，加入50mg/L的CuONPs后，ROS濃度比對照組提高了35.01%，而LDH濃度提高了51.18%。LDH的濃度表征了細胞膜的完整性，LDH的釋放意味著細胞膜被破壞，從而對細胞產生了不可逆的損害。同時通過DNA測序對微生物群落變化的研究表明氨氧化細菌（AOB）的增殖與厭氧氨氧化菌（AAOB）的抑制，推測是由于CuONPs促進了氧氣從空氣向反應器的轉移導致的。Zhao等在ZnONPs的研究中也證實了ROS的毒性作用，相比于空白對照，50mg/L的ZnONPs會使反應器中的ROS含量提高40%，ROS的存在代表著納米顆粒對厭氧氨氧化菌的氧化應激作用，它不僅會破壞細胞膜的結構和功能，還會引起糖鏈斷裂，從而對厭氧微生物產生毒害作用。然而ZnONPs的加入不會導致LDH的釋放，這意味著細胞膜的完整性未被破壞，這說明其對厭氧氨氧化菌的抑制是可逆的。
03 厭氧氨氧化菌抗納米材料毒性的機制
厭氧氨氧化菌在受到環境污染物脅迫時，會產生一系列保護機制來免受毒害作用。例如在受到納米顆粒的毒性影響時，厭氧氨氧化菌會通過分泌EPS、上調抗性基因的表達等方法來保護自己。
3.1 增加EPS分泌
相較于其他微生物，厭氧氨氧化菌周圍會存在更多的EPS。例如，在活性污泥法的SBR反應器中污泥中的EPS濃度為53.38mg/gVSS，MBR反應器中則為91.94mg/gVSS，而在厭氧氨氧化體系中，污泥中的EPS濃度通常在200mg/gVSS以上，細胞周圍的EPS可以通過吸附納米顆粒來阻止其破壞細胞膜，從而減輕納米顆粒的毒性。EPS通常被認為是保護厭氧氨氧化菌免受納米顆粒毒性的第一道屏障。
Zhang等在AgNPs對厭氧氨氧化菌的影響研究中發現，EPS可以作為吸附載體和滲透屏障，減少AgNPs與厭氧氨氧化細胞的直接接觸和相互作用，從而阻隔或緩解其對細胞的毒性。在投加50mg/L的AgNPs后，液相中的Ag濃度低于檢測限，而厭氧氨氧化顆粒中的銀含量從（2.7±0.2）mg/gSS增加到（110.5±7.8）mg/gSS，說明大部分游離的AgNPs都被細胞外圍的EPS吸附，這與Peng等的試驗結果一致。另外，通過X射線斷層攝影技術觀察到的厭氧氨氧化顆粒的微觀結構表明，納米顆粒的加入會使微生物的胞外聚合物密度降低，從而產生孔隙，而這些孔隙是底物和代謝物運輸的通道。孔隙率的增加實際上提高了厭氧氨氧化顆粒中的基質轉移效率，從而提高了微生物的活性。類似地，Xu等在投加MnO2NPs后也觀察到EPS濃度的增加。對污泥中EPS的定量分析表明，在投加納米顆粒后，顆粒污泥中EPS的含量從360.2mg/gVSS增加到481.5mg/gVSS，厭氧氨氧化菌傾向于分泌更多的EPS，以應對納米顆粒不斷增加產生的毒性。這種行為被認為是微生物的一種防御機制，通過增加EPS分泌來減少與納米顆粒的直接接觸和相互作用，從而形成保護性的“繭”。
此外，Zhang等在磁鐵礦納米顆粒（MHNPs）對厭氧氨氧化的研究中發現，MHNPs的加入使得厭氧氨氧化污泥中的EPS含量從196.5mg/gVSS增加至272.6mg/gVSS，這表明MHNPs會導致細菌加速EPS的分泌，并且EPS含量的增加可以加速絮凝污泥的造粒過程，因此MHNPs可以改善厭氧氨氧化絮凝污泥的沉降性能，同時對微生物群落的功能特異性也有一定的增強。不同納米材料對厭氧氨氧化菌EPS分泌的影響見表1。
表1 不同納米材料對厭氧氨氧化菌EPS分泌的影響
從表1可以看到，不同類型的納米顆粒的影響不盡相同，通常來說納米顆粒毒性越強，其對厭氧氨氧化菌分泌EPS的刺激效果越顯著，EPS含量增加13.3%～67.3%。
值得注意的是，Zhou等的研究證實CuONPs對厭氧氨氧化的抑制很大程度上是由于納米效應，粒徑越小，影響越嚴重。試驗表明，相同濃度下40nm尺寸的CuONPs對厭氧氨氧化活性的影響（脫氮效率下降61%）遠大于200nm（脫氮效率下降33%），這一方面是由于粒徑較大的納米顆粒更易聚集為沉淀物，從而通過出水排出；另一方面是由于大粒徑的納米顆粒會被EPS吸附，無法進入細胞內，而小粒徑有助于穿透EPS所組成的屏障，從而對細胞產生毒害作用。此研究也從側面說明了EPS對厭氧氨氧化菌的保護作用。
3.2 調控基因的表達
在納米顆粒對厭氧氨氧化系統產生抑制作用后，厭氧氨氧化菌可以通過上調相關功能基因或者抗性基因的豐度來抵抗這種抑制作用，從而保證細菌細胞的生存。例如，長期暴露于低于抑制濃度的納米銀顆粒中，可以促使厭氧氨氧化菌激活基于基因表達的離子轉運調節，用于抵抗納米銀的毒性。
在厭氧氨氧化菌的代謝途徑中，通過肼合酶（hydrazine synthase，hzsA）可以將一氧化碳和銨合成為肼（N2H4），肼合酶是一種獨特的只存在于厭氧氨氧化菌中的酶，因此通過測定hzsA基因的豐度可以表征厭氧氨氧化菌中肼合酶的豐度，從而定量評估厭氧氨氧化菌的活性。例如，在Zhang等對ZnONPs的研究中，加入納米顆粒前后，hzsA基因的拷貝數維持不變，均在5.5×109copies/gVSS左右，然而hzsA基因的相對豐度在受到沖擊時從32%降至28%，并且在隨后的恢復階段上升至36%，可以看出恢復的厭氧氨氧化生物量具有比沖擊前更高的hzsA基因豐度。
與此相似，在MHNPs對厭氧氨氧化的影響中也觀察到了類似的結果，在進水MHNPs濃度增加至200mg/L后，hzsA基因的含量從5.03×109copies/gVSS增加到7.12×109copies/gVSS，相對豐度從17.7%增加至39.2%。這說明在受到諸如納米顆粒的污染物沖擊后，厭氧氨氧化菌傾向于產生更多肼合酶來加速繁殖，以獲得更多的微生物量來抵抗納米顆粒的毒性。
Li等在研究Fe3O4NPs對厭氧氨氧化工藝的影響中也觀察到了類似的現象。在低濃度（1mg/L）Fe3O4NPs的暴露下，厭氧氨氧化菌中的離子轉運與脂質代謝的基因豐度相較對照組分別從4.85%和3.1%增至5.25%和3.5%，這是由于亞鐵離子作為一種厭氧氨氧化菌所需要的微量元素，其需要鐵轉運蛋白來進行攝取。然而在過高濃度（10mg/L）的Fe3O4NPs脅迫下，離子轉運與脂質代謝的基因豐度均會下調，證明厭氧氨氧化細菌可以通過下調與鐵轉運相關的基因來防止細胞內過量鐵的積累。
對于一部分具有毒害作用的納米顆粒，厭氧氨氧化菌還會通過上調相關抗性基因的豐度來保護自己。已有研究表明，厭氧氨氧化菌對ZnONPs的間歇性擾動有著很強的適應能力。為了減輕過量Zn2+離子造成的毒性損害，厭氧氨氧化菌可能通過上調ZntA基因（一種Zn2+離子轉運蛋白的表達基因）的豐度，從而增加Zn2+離子的排出量。與ZnONPs類似，Zhang等在向厭氧氨氧化系統中加入1mg/L 的CuNPs后發現，copA基因的相對表達量從對照組的3.56×10-4增加到12.4×10-4。copA基因可以促使厭氧氨氧化菌細胞中產生更多外排酶將有毒的Cu2+離子從細胞內排除到周質空間，從而達到減毒的作用。Peng等對加入AgNPs后厭氧氨氧化菌中的差異表達蛋白的分析結果表明，相較于沒有加入AgNPs的對照組，KEGG數據庫中的550個差異表達蛋白中有344個是上調蛋白，而下調蛋白有206個，說明AgNPs的加入導致某些功能蛋白的上調表達，加快了厭氧氨氧化菌的生長速度和豐度。
04 結語
隨著納米科技的快速發展，越來越多的納米材料被大規模應用，厭氧氨氧化作為一種新型的污水脫氮工藝，污水中日益增加的納米顆粒對其影響已經不可忽視。大多數金屬納米材料與金屬氧化物納米材料通過納米效應、重金屬離子的釋放等作用均會對厭氧氨氧化過程產生抑制，在較高濃度下甚至會導致厭氧氨氧化菌的死亡。
在受到納米顆粒的脅迫時，厭氧氨氧化菌會通過增加EPS的分泌來阻止其與細胞的接觸，同時通過上調功能基因（如hzsA基因）與抗性基因（如ZntA、copA基因）的表達來達到減毒的作用。然而現有研究大多集中在納米材料對厭氧氨氧化工藝的影響過程及機理方面，對于實際工程應用方面仍研究較少，針對現有研究成果，提出以下幾點未來的研究方向：
①大多數金屬（氧化物）納米材料由于其獨特的物化性質（納米效應、重金屬毒性等）而會抑制厭氧氨氧化過程，但是有相當一部分納米材料不僅不會抑制厭氧氨氧化反應，反而還會促進其活性，如納米零價鐵、納米氧化石墨烯等。如何利用這些材料來縮短厭氧氨氧化反應器的啟動周期或是提高厭氧氨氧化工藝的處理效率則是今后重要的研究方向。
②現有研究內容大多局限于小試規模的小型反應器，可以進一步增加對中試或工業化應用的厭氧氨氧化系統中納米顆粒的影響研究。
③各種環境條件，包括溫度和污水成分（如重金屬、有機物、抗生素等）都會對厭氧氨氧化菌的活性產生影響，納米材料與這些因素對厭氧氨氧化過程的復合影響仍需進一步研究。
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